DELFI Noorte hääl
Eile lõppenud 27. Euroopa Liidu noorte teadlaste konkursil Milanos võitis kolmanda preemia (3500 eurot) Hugo Treffneri Gümnaasiumi 2015. aasta lõpetaja Katariina Kisand oma tööga „Mitootilise proteiinkinaasiga Aurora A kovalentselt seonduvate fluorestsentssondide süntees ja biokeemiline iseloomustamine“.
Lisaks sai Katariina Euroopa Teadusuuringute Ühiskeskuse (JRC) eripreemia, milleks on auhinnareis JRC teaduskeskusesse ISPRAs.
Kokku esitati konkursile Milanos 104 uurimisprojekti 38st riigist. Konkursitööd jagunesid ühetesitkümneks teemakategooriaks ja töid hindas rahvusvaheline erinevate valdkondade esindajatest koosnev žürii.
Katariina Kisandi töö osales keemia valdkonna kategoorias ning selle keskmes on organismile oluline rakujagunemist reguleeriv ensüüm Aurora A, mis on oluline ka ravimmärklauana. Preemiatöö ja sellele järgnevate tööde tulemused on rakendatavad nii ravimiarenduses kui ka diagnostika parandamisel ning selleks vajalike meetodite ja metoodikate arendusel. Katariina juhendajad olid Darja Lavõgina Tartu Ülikoolist ja Eha Paabo Hugo Treffneri Gümnaasiumist.
Eestit esindasid konkursil veel Georg Kuusik Tallinna Inglise Kolledžist, Karl Kiur Saar Tallinna Reaalkoolist ja Ago Ambur Rapla Ühisgümnaasiumist - kõik 2015. a lõpetajad. Eesti esindajad valiti Milanosse 2015. aasta Eesti õpilaste teadustööde riikliku konkursi tulemuste põhjal. Konkurssi korraldab ja õpilasi valmistab rahvusvahelistel konkurssidel osalemiseks ette Eesti Teadusagentuur, noori saadab Reet Rannik (Eesti Teadusagentuur).
Loe veel:
VIDEO: Tallinna Reaalkooli direktor: ei tohi öelda, et reaalained on rasked! (3) 11. september 2015
Tallinna Reaalkool ja Tallinna Kesklinna põhikool püstitasid koos maailmarekordi 09. september 2015
Loe kokkuvõtet Katariina Kisandi uurimistööst!
Mitootilise proteiinkinaasiga Aurora A kovalentselt seonduvate fluorestsentssondide süntees ja biokeemiline iseloomustamine
Katariina Kisand, 12. klass
Hugo Treffneri Gümnaasium
Juhendajad: Darja Lavõgina (Tartu Ülikool), Eha Paabo (Hugo Treffneri Gümnaasium)
Aurora A kuulub mitootiliste proteiinkinaaside hulka, millel on tähtis roll rakutsükli regulatsioonis. Proteiinkinaasid katalüüsivad substraatvalkude fosforüülimist, sidudes selleks oma vastavatesse taskutesse fosforüülitava substraatvalgu ja ATP, mis on fosforüülrühma doonoriks. Fosforüülrühma lisamine substraatvalgule toimib kui lüliti, muutes viimase konformatsiooni ja aktiivsust. Proteiinkinaasidest ja nende substraatidest moodustuvad fosforüülimisrajad, mis tagavad erinevate rakusiseste protsesside regulatsiooni vastavalt saadud signaalidele.
Antud töö käigus sünteesiti mitootilisele Aurora A kinaasile pöördumatud fluorestsentsondid. Sondide koostisesse kuulusid omavahel linkeri kaudu ühendatud ATP-d jäljendav fragment VX-689 ja peptiidne osa ning fluorestsentsmärgis. Peptiidses osas sisaldasid sondid lüsiinijääki, millele konjugeeriti fluorestsentsmärgis, ning fenüülalaniini (Sond 1) või selle analoogi, mille aromaatse tuuma para-asendis oli kas asiid- (Sond 2) või bensoüülrühm (Sond 3). Asiid- ja bensoüülrühmad on valgustundlikud ning annavad UV kiirguse toimel vabu radikaale, mille reageerimisel naabruses olevate kinaasi koostisse kuuluvate keemiliste sidemetega võivad tekkida kovalentsed kompleksid.
Sondide sünteesiks kasutati Fmoc-tahkefaassünteesi strateegiat. Kiiritamata sondide seondumise võimet Aurora A-ga iseloomustati fluorestsentsi anisotroopia mõõtmisel põhineva meetodiga. Sondide võimet anda UV-kiirgusega kiiritamise järel kovalentset kompleksit kinaasiga jälgiti geel-elektroforeesiga.
Sondide seondumisafiinsused Aurora A-le olid parim Sondil 1 (mittekovalentse kompleksi dissotsiatsioonikonstant KD < 1 nM). Sond 2 afiinsus oli Sond 1 omast 2-4 korda väiksem. Sondil 3 oli kõigist sondidest halvim afiinsus, aga ühendi hüdrofoobsuse tõttu oli antud eksperimendis ka suur mõõtemääramatus. Kõige paremini andis kovalentse kompleksi proteiinkinaasiga Aurora A fototundlik fluorestsentssond Sond 2. Kuna sond andis kovalentse sidumise suhteliselt lühikese kiiritusaja järel (alla 15 min võimsusel 300 W), on lootust optimeeritud sondi kasutada ka elusrakkudes, sest rakkude kahjustamise vältimiseks tuleb kasutada võimalikult väikest kiiritamisaega. Kovalentse kompleksi tekkimisel kinaasi ja sondi vahel osutus limiteerivaks kinaasi kontsentratsioon, mida tuleks arvestada sondi kasutamisel keerulisemates bioloogilistes süsteemides.
Töö edasiarendusena võiks proovida kovalentse kompleksi tekkimiseks vajaliku kiiritamise kestust veelgi lühendada. Lisaks tuleks sünteesida ühendeid, millel oleks väiksem hüdrofoobsus, et vähendada ainete mittespetsiifilist seondumist pindadele, mis aitaks neid saaks paremini iseloomustada. Samuti võiks D-aminohapete kasutamine muuta ühendeid bioloogiliselt stabiilsemaks. Optimeeritud ühendeid on edaspidi plaanis kasutada fluorestsentssondidena ka rakulüsaadis ja elusrakkudes Aurora A kinaasi hulga ja/või asukoha määramiseks.
Töö keskmes on organismile oluline rakujagunemist reguleeriv ensüüm Aurora A, mis on oluline ka ravimmärklauana. Käesoleva ja sellele järgnevate tööde tulemused on rakendatavad nii ravimiarenduses kui ka diagnostika parandamisel ja selleks vajalike meetodite ja metoodikate arendusel.
